PCR實(shí)驗(yàn)室裝修-規(guī)劃設(shè)計(jì)

一、 PCR實(shí)驗(yàn)室改造平面布局

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行。

二、PCR實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制

PCR實(shí)驗(yàn)室并沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。

1、試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。

對(duì)與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴(yán)格的要求。

2、標(biāo)本制備區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。

3、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或 cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的 cDNA(來自樣本制備區(qū)) 的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū)) 制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式 PCR測(cè)定中，通常在di一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。

本區(qū)是主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。

三、PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)關(guān)于污染的預(yù)防與控制

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。

1、工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分

（1）各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理；

（2）各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。

2、合理的系統(tǒng)設(shè)置

（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；

（2）嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

3、規(guī)范的操作

（1）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的工作；

（2）在實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施；

（3）清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，必須立即對(duì)本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對(duì)表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對(duì)一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。

4、嚴(yán)格的管理

（1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的門；

（2）在各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服（如不同顏色），當(dāng)工作人員離開時(shí)不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；

（3）盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性。

（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；

（5）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

5、完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施

完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、加樣器等。

PCR實(shí)驗(yàn)室裝修-規(guī)劃設(shè)計(jì)

 PCR病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室在近的新型肺炎病毒防控中起到重要作用。為了防止交叉污染，緩沖間和核心工作間一定要設(shè)置為負(fù)壓，清潔區(qū)則設(shè)置為常壓。對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室的各實(shí)驗(yàn)房間壓差控制一定要嚴(yán)格處理，尤其是基因擴(kuò)增和產(chǎn)物區(qū)的氣流不能互相串通，以免引起檢測(cè)提取數(shù)據(jù)的重疊失效。

一、無菌潔凈間的壓差控制重要性

對(duì)于無菌負(fù)壓潔凈間我們經(jīng)常會(huì)碰到塵埃粒子檢測(cè)不達(dá)標(biāo)的問題，SAREN經(jīng)過多次的現(xiàn)場(chǎng)考察和多年的檢測(cè)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)可以得出以下兩個(gè)問題：塵埃粒子問題，房間的負(fù)壓設(shè)定值越高其潔凈難度也就會(huì)越高，對(duì)于我們施工的工藝要求也就越高，顧名思義負(fù)壓潔凈間的大氣壓要比室外空氣大氣壓力低，潔凈間根據(jù)要求設(shè)計(jì)負(fù)壓值越高，相對(duì)室外大氣壓值就會(huì)相差越大，如果施工工藝不到位就會(huì)導(dǎo)致負(fù)壓潔凈間的墻壁接縫，照明燈具電源線孔，吊頂板材開孔的高翔箱體縫隙，墻壁開孔的強(qiáng)弱電插座即插座孔等都是室外非經(jīng)過處理的氣壓空氣進(jìn)入負(fù)壓潔凈間的路徑，從而導(dǎo)致負(fù)壓潔凈間的塵埃粒子超標(biāo)的現(xiàn)象。

負(fù)壓潔凈間的潔凈級(jí)別和緩沖間潔凈級(jí)別應(yīng)一致或更高，緩沖間和負(fù)壓間的潔凈級(jí)別一致或更高級(jí)別后負(fù)壓潔凈間的潔凈氣體才會(huì)一致，潔凈級(jí)別才會(huì)有保障。

二、實(shí)驗(yàn)室壓差控制的原理

根據(jù)PCR操作流程方向，試劑準(zhǔn)備，標(biāo)準(zhǔn)制備，擴(kuò)增區(qū)，產(chǎn)物分析區(qū)。相對(duì)壓差也應(yīng)從試劑準(zhǔn)備至產(chǎn)物分析方向由高到低的過程。不過在實(shí)際的使用調(diào)劑過程中我們會(huì)遇到緩沖的氣壓很難調(diào)到設(shè)定值，若擴(kuò)增和產(chǎn)物緩沖區(qū)的—5~—10Pa，在調(diào)試過程中會(huì)出現(xiàn)壓差不平衡的問題，比如潔走廊往緩沖方向流入緩沖就是小負(fù)壓室，緩沖再被動(dòng)流入負(fù)壓內(nèi)室就應(yīng)變?yōu)檎龎?，從而緩沖間排風(fēng)大于送風(fēng)量，也就是送風(fēng)設(shè)置為關(guān)閉狀態(tài)后基本可以實(shí)現(xiàn)負(fù)壓的設(shè)定值，因此關(guān)閉送風(fēng)維持負(fù)壓狀態(tài)是不可行的。

其實(shí)我們只要了解PCR關(guān)鍵性能后也可以取另外的方式來實(shí)現(xiàn)氣流合理性的控制，比如PCR緩沖間理解為第二氣閥室(室內(nèi)與緩沖間是兩層隔離屏障，潔凈走廊對(duì)外是di一層屏障)，所以緩沖間的設(shè)置為相對(duì)或者的正壓值是很有必要也是符合使用標(biāo)準(zhǔn)的。

三、PCR實(shí)驗(yàn)室功能區(qū)的壓力控制標(biāo)準(zhǔn)

① 壓力梯度-好在10Pa及以上

② 兩種控制方式：系統(tǒng)控制和排風(fēng)功率變化。系統(tǒng)控制即4個(gè)房間的壓力控制應(yīng)同時(shí)啟停；排風(fēng)控制即排風(fēng)管道應(yīng)分支，否則實(shí)驗(yàn)室停運(yùn)時(shí)風(fēng)流倒灌，造成污染。

③ 試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染；可以通過控制進(jìn)風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達(dá)到正壓效果。

④ 核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓，以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散出去污染試劑與樣品，可以通過控制排風(fēng)風(fēng)量大于進(jìn)風(fēng)風(fēng)量達(dá)到負(fù)壓效果。

⑤ 在理想情況下，PCR實(shí)驗(yàn)室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)風(fēng)由原有中央空調(diào)控制，要求將中央空調(diào)風(fēng)口安裝到定點(diǎn)，且高度為地面鋪裝好后2600mm處。